Résumé de la PCR

Plan
1. Définition
2. Principe
3. Acteurs de la PCR
4. Réaction
5. Applications


1. Définition et historique

En 1983, Karry Mullis met au point une technique d’amplification de l'ADN : la PCR ( Polymerase Chain Reaction ou Réaction de Polymérisation en Chaîne). Aujourd’hui, c’est une technique incontournable et couramment utilisée dans les laboratoires.
En deux mots, c'est une réaction enzymatique qui permet de sélectionner puis d’ amplifier en une très grande quantité un fragment d’ADN particulier, présent en très faible quantité au départ, parmi des millions d’autres fragments.

2. Principe

La PCR est une suite de cycles, qui se répètent en boucle, comportant chacun trois paliers de température. De plus, chacun de ces paliers est caractérisé pas une réaction chimique distincte. En moyenne une PCR comporte entre 20 et 40 cycles.

3. Les acteurs de la PCR sont :

👉 L' ADN
Avant la réaction de PCR, l’ ADN est extrait à partir de l’ échantillon que l’on veut analyser ( salive, cheveux, cellules, fossile…) . Puis , cet extrait purifié en ADN, contenant le fragment d’ ADN que l'on souhaite amplifier, peut être utilisé en PCR.

👉Les deux amorces
Ce sont des fragments courts d'ADN, capables de s'hybrider de façon spécifique, grâce à la complémentarité des bases , sur l' un des deux brins d' ADN. Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d' ADN à amplifier. La taille de ces amorces est généralement d’ une vingtaine de désoxyribonucléotides. De plus, les amorces sont en très forte concentration par rapport à celle de l'ADN. à amplifier.

👉Les DésoxyriboNucléotides-Tri-Phosphates (dATP , dCTP, dGTP, dTTP)
Les dNTPs ( Désoxyribonucléotides-Tri-Phosphates ) sont des molécules de base , qui constituent l’ADN , utilisés par la Taq polymérase pour la synthèse du nouveau brin d’ADN complémentaire.

👉L' enzyme , Taq polymérase
L ’ enzyme utilisée est une polymérase , c'est- à-dire qu’ elle peut synthétiser un nouveau brin d’ADN à partir du brin d’ADN matrice après s’être fixée à une amorce.

👉Le milieu réactionnel
Le milieu réactionnel de la PCR comporte l’ADN à amplifier, les dNTPs , les deux amorces, la Taq polymérase, un tampon et des ions magnésium ( MgCl 2). Ces deux derniers composants définissent un milieu avec un pH optimal et une concentration saline optimale pour le bon fonctionnement de l’enzyme.

4. Réaction

La PCR est une technique automatisée. En effet, la réaction de PCR se fait dans un thermocycleur.
L’appareil contient un bloc chauffant où l’ on insère les tubes contenant notre mélange pour la réaction de PCR et où la température peut varier très rapidement et très précisément de 0° C à 100° C.
Le thermocycleur est alors programmé pour effectuer les différents cycles de la PCR. Ainsi, chaque cycle est composé d’ une succession de paliers de température prédéterminée , et d’une durée bien définie. Ces deux paramètres, température et temps, dépendent de la taille de la séquence à amplifier de la taille et de la composition en désoxyribonucléotides des amorces.

Chaque cycle est donc constitué de trois périodes différentes :
•Dénaturation
•Hybridation
•Elongation

• La dénaturation

La température dans le tube est réglée à 95° C. A ce moment là, l’ ADN se dénature .
En effet, l’ ADN perd sa structure caractéristique en double hélice, les liaisons hydrogène reliant les bases de chaque brin d’ ADN étant instables à cette température. L’ADN double - brin ( 2 brins ) est dénaturé en ADN simple brin ( 1 brin).

• L 'hybridation

Ensuite la température est descendue à la température dite d’ hybridation. Cette dernière est généralement comprise entre 50°C et 60° C et elle est fonction de la composition en désoxyribonucléotides ( dATP, dTTP, dGTP, et dCTP) des amorces . Les amorces reconnaissent et se fixent à leurs séquences complémentaires en reformant des liaisons hydrogène. On dit que les amorces s’ hybrident au brin d’ADN.

 •L'élongation

Puis la température est réglée à 72° C , température idéale pour l’ activité de la Taq polymérase .
C'est une enzyme très spéciale, puisqu ’ elle est dite thermorésistante, parce que sa température optimale d 'action est de 72°C et qu' elle est capable de résister à des températures allant jusqu’ à 100 °C .

Cette Taq polymérase est extraite d’ une bactérie extrêmophile, T hermus aquaticus, qui ne vit que dans les sources chaudes. En effet, c' est en 1969 que Thomas Brock découvre cette bactérie thermophile, dans le plus grand geyser du monde, le Steamboat Geyser, au parc de Yellowstone aux Etats- Unis .

Cette étape permet à la Taq polymérase de synthétiser le brin complémentaire à l’ ADN matrice, grâce aux dNTPs libres présents dans le milieu réactionnel .
Au cycle suivant, les nouveaux fragments synthétisés servent à leur tour de matrice pour la synthèse de nouveaux fragments d’ ADN. En théorie, à la fin de chaque cycle , la quantité d’ ADN cible est doublée .
Le premier cycle est fini et voilà qu ’ un nouveau cycle recommence . Cela se reproduira environ 30 fois (en fonction du protocole de PCR) comme vous pouvez le voir sur le schéma. A partir d’ une seule copie d’ADN cible, on pourra donc obtenir 1 milliard de copies d’ADN cible.

5. Applications de la PCR

La PCR est très couramment utilisée dans de nombreux domaines :
👉En médecine, pour diagnostiquer des maladies génétiques ( myopathie, mucoviscidose), des infections virales ( SIDA , Hépatite C , SRAS ), bactériennes (tuberculose) ou parasitaires (toxoplasmose) , mais aussi des cancers.
-En recherche fondamentale: multiples applications routinières
-En médecine légale: pour identifier une personne par son empreinte génétique dans le cadre d ’ une enquête judicaire
pour un test de paternité .

👉En agroalimentaire

Pour identifier des variétés ou des espèces végétales et animales, pour sélectionner de nouvelles variétés de fruits et légumes, comme la tomate,
pour le contrôle de la qualité des produits agroalimentaires, détecter la présence d’ OGM dans un aliment par exemple.

👉En histoire

Pour des études phylogénétiques sur des squelettes fossiles (ADN fossile), rechercher les liens de parenté entre les individus (cas les plus célèbres : les enfants de Louis XVII, ou ceux du tsar Nicolas II)
pour l’ étude des migrations des populations humaines et animales (en Islande , les indiens d'Amérique)
pour la détection d’ infections virales, bactériennes et parasitaires sur des momies égyptiennes et andines (par exemple H - C Li et son équipe ont montré la présence du virus HTLV- 1, à l ’ origine du SIDA , dans des momies de la Cordillère des Andes datant de plus de 1500 ans).

Image d'un thermocycleur

Par Leclair Mengi Meli, G2 UK-FAMÉD
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Vendredi 26-06-2020